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Alt 18.06.2019, 18:04   #1   Druckbare Version zeigen
PaddyTime Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 118
Frage Proteine voneinander trennen / Stabilisatoren beseitigen / Konjugation

Hallo liebe Communitiy,

ich habe ein großes Protein-Enzym-Konjugat (=PE-Konjugat, Konzentration 1 mg/ml) von einer Firma (deren Name ich nicht nenne) erhalten und möchte dieses nutzen, um daran weitere Kopplungsreaktionen durchzuführen. Damit das Protein-Enzym-Konjugat stabil bleibt, wurden Stabilisatoren hinzugegeben. Unter anderem Glykol (damit die Lagerung bei -20 °C möglich ist) und weitere kleine Proteine (ich gehe von BSA aus).

Um nun meine Konjugationen durchzuführen stören diese Additive definitiv und ich möchte sie beseitigen. Prinzipiell ist das ja kein Problem. Man könnte eine SEC o. Ä. durchführen und dann die entsprechenden Fraktionen poolen und aufkonzentrieren oder einfach über einen Zentrifugalfilter mit entsprechend großes Cutoff (100 kDa, 300 kDa, ggfs. noch 50 kDa). Das PE-Konjugat ist deutlich größer und daher wäre das unproblematisch.

Mein Problem liegt aber eben bei diesen Zentrifugalfiltern. Ich habe jetzt schon 2x meine Synthese vorbereitet, das heißt: ich wollte die Stabilisatoren durch Zentrifugieren (4000 rpm, 4°C) entfernen und habe in beiden Fällen festgestellt, dass sehr viel PE-Konjugat an der Membran haftet (100 kDa Cutoff, PES-Membran) und ich dieses mit meinem Puffer einfach nicht resuspendiert bekomme. Ich spreche da von Verlusten bis zu 90 %. Im Zentrifugat befindet sich das PE-Konjugat nicht. Das habe ich ebenfalls überprüft.

Ich habe auch schon Zentrifugalfilter mit kleineren Cutoffs getestet. Bei einem 10 kDa Cutoff (ebenfalls PES-Membran) hab ich einen Verlust von 40 %. Mit diesem würde ich lediglich das Glykol beseitigen können, aber nicht das BSA (?). Es war aber ein erster Versuch zur Problemlösung.

Nun gibt es natürlich noch weitere Membranen, die andere Polymere zur Grundlage haben:
Zum Beispiel Regenerierte Cellulose oder Poly(acrylnitril).
Wären das Alternativen zur PES-Membran oder ist deren Adsorptionsvermögen von Proteinen vergleichbar groß wie beim PES/modifizierten PES?

Ich habe bereits hier im Forum gelesen, dass man die Oberfläche der Membranen auch vor der eigentlichen Trennung mit BSA absättigen kann, damit die Proteine weniger stark adsorbieren. Hat damit schon einmal jemand Erfahrungen gemacht? Löst sich das BSA wieder von dem Filter ab? Es wäre natürlich lächerlich, wenn ich BSA aus meiner Lösung haben möchte, aber dazu BSA-beschichtete Membranen nutze aus der sich das BSA ablöst *grübel*


Was ich noch nicht probiert habe, aber morgen evt. mal versuchen werde ist, dass ich eine Vorreinigung mittels SEC durchführe (wie ich es oben schon angedeutet habe) und dann die gepoolten Fraktionen mittels Zentrifugalfilter aufkonzentriere. Aber ich habe die Befürchtung, dass dadurch das Adsorptionsproblem nicht gelöst werden kann.

Aufkonzentrierungsschritte während und nach der Synthese sind unerlässlich, deswegen muss ich das Problem irgendwie gelöst bekommen.

Hat jemand Tipps oder ggfs. Erfahrung was man noch machen kann?

Im Voraus vielen Dank für Eure Antworten.

Liebe Grüße
PaddyTime ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 19.06.2019, 05:57   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.001
AW: Proteine voneinander trennen / Stabilisatoren beseitigen / Konjugation

Kannst Du eine kleine Menge per analytischer SEC charakterisieren, um herauszufinden, ob zB BSA dabei ist oder nur kleines Zeugs.

Dann würde ich entweder umsalzen (NAP5/PD10 bzw. Sephadex G25) oder eine präparative SEC durchführen (Sephacryl S200 oder S300 oder was halt verfügbar ist).

Die unspezifische Bindung an das Säulenmaterial kann man mit BSA gut in den Grff bekommen (ein Bisschen leakt natürlich immer) oder nichtionischen Detergentien (zB Tween 20) oder auch high salt. Evtl rumprobieren und auch definieren, ab welcher Konz. bzw. Menge das BSA stört bzw. welches Potein man sonst nehmen könnte.
Ist Dein Konjugat ein Antikörper? Dann gäbs noch andere Möglichkeiten.
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imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 19.06.2019, 06:57   #3   Druckbare Version zeigen
PaddyTime Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 118
AW: Proteine voneinander trennen / Stabilisatoren beseitigen / Konjugation

Ja ich denke, dass ich das mit analytischer SEC hinbekommen könnte.

Ich glaube Tenside sind auch drin, zumindest hat es bei den Resuspensionsversuchen sehr oft geschäumt. Mit dem BSA das werde ich mal versuchen.

Ein Antikörper ist es nicht, aber der soll dort später noch dran. Wenn der dran ist, könnte man über über die spezifischen Antikörper-Antigen-Bindungen gehen(bzw. immobilisierter Antikörper, der den anderen Antikörper spezifisch erkennt und bindet), oder was meinen Sie?
PaddyTime ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 19.06.2019, 17:54   #4   Druckbare Version zeigen
imalipusram Männlich
Mitglied
Beiträge: 7.001
AW: Proteine voneinander trennen / Stabilisatoren beseitigen / Konjugation

Wenn Du einen Antikörper gegen Dein Protein hast, könntest Du diesen immobilisieren (NHS-Sepharose o.Ä.) und Affinitätschromatographie betreiben. Dann ist der ganze andere "Mist" weg. Dein Protein könnte aber bei der zu erwartenden Verdünnug Stabilitätsprobleme bekommen.

Zur Markierung allgemein: Du mußt gucken, was wie stört. Tenside und Glycol tun das bei der Markierung (NHS-Ester, Isocyanate) idR nicht, Evtl. zugesetzte Aminosäuren sind natürlich der Killer. BSA kompetitiert halt, ließe sich bei Bedarf mit einer Affisäule recht einfach entfernen (siehe PN).
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imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 22.06.2019, 11:53   #5   Druckbare Version zeigen
PaddyTime Männlich
Mitglied
Themenersteller
Beiträge: 118
AW: Proteine voneinander trennen / Stabilisatoren beseitigen / Konjugation

Vielen Dank für die Antworten. Auch für die PN. Ich werde es im Hinterkopf behalten, aber für das jetzige Problem wird das nicht notwendig sein.

Ich habe eine SEC durchgeführt und habe in der Probe tatsächlich keine weiteren Stabilisatoren gesehen (außer Glycerol). Ich habe die Fraktionen den Konjugats gepoolt und dann über Zentrifugalfilter aufkonzentriert.

Die Adsorption an die Membran scheint ein Puffer-Problem gewesen zu sein. In meinem Puffer war in geringer Konzentration EDTA zugesetzt. Als ich das EDTA weg gelassen habe, konnte ich die Probe deutlich besser resuspendieren. Mir ist allerdings nicht schlüssig, wieso bzw. wie EDTA mit einer PES-Membran interagiert. Ich könnte mir höchstens vorstellen, dass Metallionen in den Proteinen vom EDTA komplexiert worden sind und dadurch größere Komplexe entstanden sind, die schlechter löslich wurden, aber ich bezweifle eigentlich, dass es tatsächlich so ist.

Hat jemand schon einmal etwas ähnliches beobachtet?
PaddyTime ist offline   Mit Zitat antworten
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